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    • 专利摘要:
    本發明係有關於一種三重交聯膠原蛋白之製造方法，包括：提供一可溶性之膠原蛋白樣品；混合該膠原蛋白樣品與一第一交聯劑，以形成一重交聯之膠原蛋白；混合該一重交聯之膠原蛋白與一第二交聯劑，以形成二重交聯之膠原蛋白；以及混合該二重交聯之膠原蛋白與一第三交聯劑，以形成三重交聯之膠原蛋白。其中，第一交聯劑、第二交聯劑、及第三交聯劑係分別選自由：醛類交聯劑、亞胺類交聯劑、及環氧化物交聯劑所組成之群組，且第一交聯劑係異於第二交聯劑，第三交聯劑係異於第一交聯劑、及第二交聯劑。
    公开号:TW201307383A
    申请号:TW100128378
    申请日:2011-08-09
    公开日:2013-02-16
    发明作者:Yu-Te Lin；Chien-Hsin Lin；Hsiang-Yin Lu；Feng-Huei Lin
    申请人:Sunmax Biotechnology Co Ltd；
    IPC主号:A61K31-00
    专利说明:
    一種三重交聯之膠原蛋白、製造方法及其用途
    本發明主要係關於一種三重交聯之膠原蛋白之製造方法，尤指一種適用於製造高熔點、低酵素降解率、及高穩定性的三重交聯之膠原蛋白，並將此三重交聯之膠原蛋白應用於需長期植入膠原蛋白之醫學治療。
    膠原蛋白存在於人體結締組織中，是構成骨骼、軟骨、肌腱、韌帶、血管、眼角膜、基底膜、及皮膚等組織器官之結構基質。由於膠原蛋白具備有低免疫反應之特性，因此，經常被應用於醫療及組織工程上，以補強或保護人體組織。
    然而，以膠原蛋白為主要組成之相關醫療材料，通常植入人體後，即會於很短時間內被體內酵素降解而代謝消失，因此大多應用於醫療材料之膠原蛋白係需要先經過交聯反應後，以形成結構較為穩定之膠原蛋白，才能進行人體植入。
    目前，大多膠原蛋白之交聯反應可分為物理交聯法或化學交聯法。其中，物理交聯法係以放射性同位素、紫外線、或脫水加熱法等進行交聯反應，然而，物理交聯法容易對膠原蛋白產生一定程度之破壞，而導致膠原蛋白變性或產生降解，故物理交聯法較不適合用應用於製造醫療材料之交聯膠原蛋白。另外，化學交聯法係以化學交聯劑進行交聯反應，然而，以習知之化學交聯劑進行交聯反應後之膠原蛋白，不但部份會對人體產生毒性，亦無法大幅改善膠原蛋白之熔點、及酵素降解率，故僅能將其暫時的植入人體或是限制其於醫療之應用。事實上，大多膠原蛋白之交聯反應僅進行膠原蛋白分子間及/或及分子內之胺基與胺基共價交聯，然而，膠原蛋白除了具有胺基官能基之外，亦有羧基官能基。因此，若僅進行胺基與胺基之交聯，則容易產生交聯不均且低交聯度之膠原蛋白纖維，使其抗酵素分解性無法達到預期。
    有鑑於此，提供一種可製造出高交聯度膠原蛋白之方法，不但可降低膠原蛋白被酵素降解之速率，亦可增加其穩定度，以提供醫療材料界更多之選擇。
    本發明主要目的係在提供一種三重交聯之膠原蛋白之製造方法，俾能使膠原蛋白產生高度交聯，以提昇其熔點及降低其酵素降解率，並增強其穩定性。
    本發明之另一目的係在提供一種包含三重交聯之膠原蛋白之組合物，俾能利用其高穩定性、高熔點及低酵素降解率之特性，以應用於高穩定性需求之醫療材料。
    為達成上述目的，本發明乃提供一種三重交聯之膠原蛋白之製造方法，包括：首先，提供一可溶性之膠原蛋白樣品；混合此膠原蛋白樣品與一第一交聯劑，以形成一重交聯之膠原蛋白；再則，混合此一重交聯之膠原蛋白與一第二交聯劑，以形成二重交聯之膠原蛋白；最後，混合其二重交聯之膠原蛋白與一第三交聯劑，以形成三重交聯之膠原蛋白。其中，上述之第一交聯劑係為一選自由：醛類交聯劑、亞胺類交聯劑、及環氧化物交聯劑所組成之群組；而上述之第二交聯劑係為一選自由：醛類交聯劑、亞胺類交聯劑、及環氧化物交聯劑所組成之群組，且此第二交聯劑係異於上述之第一交聯劑；另外，第三交聯劑係為一選自由：醛類交聯劑、亞胺類交聯劑、及環氧化物交聯劑所組成之群組，且此第三交聯劑係異於第一交聯劑以及第二交聯劑。因此，上述之第一交聯劑、第二交聯劑、及第三交聯劑分別為不同類之交聯劑。
    另外，於上述三重交聯之膠原蛋白之製造方法中，在形成三重交聯之膠原蛋白後，可更包括有一步驟：混合其三重交聯之膠原蛋白於過量之甘胺酸(glycine)溶液中，另以中性之磷酸緩衝溶液清洗並中和此三重交聯之膠原蛋白。
    而以上述本發明之製造方法所形成之三重交聯蛋白，其交聯度可達70-90%，熔點可達80-95℃，另外，酵素降解率可小於10%。
    上述之醛類交聯劑無特別限制，較佳係至少一選自由：甲醛、乙二醛、及戊二醛所組成之群組，最佳係為戊二醛。此外，本發明所使用之醛類交聯劑，其交聯反應係為胺基與胺基間之共價交聯反應，因此，醛類交聯劑係能使膠原蛋白分子間及分子內之胺基與胺基間，進行交聯反應。而於醛類交聯劑之交聯反應條件中，酸鹼值可為偏中性，較佳係介於約pH 6至pH 9之間，更佳係介於pH 6.5至pH 7.5之間，最佳係介於pH 6.8至pH 7.3之間。另外，醛類交聯劑之反應溫度無特別限制，只要不使膠原蛋白樣品變性即可，較佳係介於20℃至50℃之間，更佳係介於25℃至40℃之間，最佳係介於28℃至35℃之間。再則，於反應濃度上，亦無特別限制，只要能於膠原蛋白分子間及/或分子內進行胺基與胺基之交聯反應即可，較佳之反應濃度係介於15 ppm至70 ppm之間，更佳係介於25 ppm至50 ppm之間，最佳係介於30 ppm至40 ppm之間。
    而上述之亞胺類交聯劑無特別限制，較佳係至少一選自由：1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺(1-ethyl-3-(3dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride(EDC))、1-環己基-3-(2-碼咻代乙基)碳化二亞胺(1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimide(CMC))、二環己基碳化二亞胺(dicyclohexyl carbodiimide(DCC))、及二異丙基碳化二亞胺(diisopropyl carbodiimide(DIC))。最佳為1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺(1-ethyl-3-(3dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride(EDC))。此外，本發明所使用之亞胺類交聯劑，其交聯反應係為胺基與羧基間之共價交聯反應，因此，亞胺類交聯劑係能使膠原蛋白分子間及/或分子內之胺基與羧基進行交聯反應。另外，本發明所使用之亞胺類交聯劑可包括N-羥基-丁二酸亞醯胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)，將亞胺類交聯劑與N-羥基-丁二酸亞醯胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)混合，以形成本發明另可使用之亞胺類交聯劑混合物(EDC/NHS)。其中，亞胺類交聯劑與N-羥基-丁二酸亞醯胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)混合莫耳比無特別限制，較佳係約為1：1、2：1、5：1、及5：2，更佳係約為2：1、5：1、及5：2，最佳係為5：1。而於亞胺類交聯劑之交聯反應條件中，酸鹼值可為偏酸性酸鹼值，較佳係介於pH 4至pH 6之間，更佳係介於pH 4.5至pH 5.8之間，最佳係介於pH 5.2至pH 5.7之間。另外，亞胺類交聯劑之反應溫度無別限制，只要不使膠原蛋白樣品變性即可，較佳係介於30℃至50℃之間，更佳係介於35℃至45℃之間，最佳係介於38℃至42℃之間。再則，於反應濃度上，亦無特別限制，只要能於膠原蛋白分子間及/或分子內進行胺基與羧基之交聯反應即可，較佳之體積百分濃度係介於0.5%至5%之間，更佳係介於1%至4%之間，最佳係介於1%至3%之間。
    另外，上述之環氧化物交聯劑無特別限制，較佳係至少一選自由：1,4-丁二醇二縮水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether,BDDE)、乙二醇二縮水甘油醚(ethylene glycol diglycidyl ether,EGDGE)、縮水甘油醚(glycerol polyglycidyl ether)、及二縮水甘油醚(diglycerol polyglycidyl ether)所組成之群組，更佳係為1,4-丁二醇二縮水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether,BDDE)、乙二醇二縮水甘油醚(ethylene glycol diglycidyl ether,EGDGE)，最佳係為1,4-丁二醇二縮水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether,BDDE)。此外，本發明所使用之環氧化物交聯劑，於鹼性反應條件下，其交聯反應係為胺基與胺基間之共價交聯反應；而於酸性反應條件下，其交聯反應係為羧基與羧基間之共價交聯反應。因此，環氧化物交聯劑於鹼性反應條件下，係能使膠原蛋白分子間及/或分子內之胺基與胺基間，進行交聯反應；而於酸性反應條件下，係能使膠原蛋白分子間及/或分子內之羧基與羧基間，進行交聯反應。於本發明環氧化物交聯劑之反應條件中，酸鹼值係為偏酸性，較佳係介於pH 3至pH 5之間，更佳係介於pH 4至pH 4.8之間，最佳係介於pH 4.3至pH 4.7之間。另外，環氧化物交聯劑之反應溫度無別限制，只要不使膠原蛋白樣品變性即可，較佳係介於30℃至50℃之間，更佳係介於35℃至45℃之間，最佳係介於38℃至43℃之間。再則，於反應濃度上，亦無特別限制，只要能於膠原蛋白分子間及/或分子內進行羧基與羧基之交聯反應即可，較佳之體積百分濃度係介於0.5%至4%之間，更佳係介於1%至3%之間，最佳係介於1%至2.5%之間。
    於上述本發明中，較佳之第一交聯劑係可進行胺基與胺基間之共價交聯反應。因此，較佳之第一交聯劑係為醛類交聯劑、或鹼性條件下之環氧化物交聯劑，更佳係為醛類交聯劑，最佳係為醛類交聯劑之戊二醛。
    上述本發明之膠原蛋白樣品係包含一膠原蛋白纖維，且本發明之膠原蛋白樣品之物種來源並無限制，較佳係至少一選自由：牛源膠原蛋白、豬源膠原蛋白、羊源膠原蛋白、馬源膠原蛋白、魚源膠原蛋白、及人類膠原蛋白所組成之群組，更佳係為牛源膠原蛋白、豬源膠原蛋白、魚源膠原蛋白、及人類膠原蛋白。此外，本發明之膠原蛋白樣品可為至少一選自由：第一型膠原蛋白、第二型膠原蛋白、第三型膠原蛋白、第四型膠原蛋白、及第五型膠原蛋白所組成之群組，較佳係為第一型膠原蛋白、第二型膠原蛋白，更佳係為第一型膠原蛋白。再則，本發明所使用之膠原蛋白樣品除了上述之外，亦可為上述膠原蛋白之重組膠原蛋白纖維，以利膠原蛋白之共價交聯反應進行。
    本發明另提供一種三重交聯之膠原蛋白之組合物，包括：以上述三重交聯之膠原蛋白之製造方法所製得之三重交聯之膠原蛋白，以及一載劑。其中，此三重交聯之膠原蛋白之交聯度係可為70-90%，熔點係可為80-95℃，且酵素降解率係可小於10%。另外，載劑可包含甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素纖維素乙酸酯鄰苯二甲酸酯、羥丙基纖維素與羥丙基甲基纖維素之纖維素化合物、聚乙烯氯、聚乙烯　咯烷酮、硬脂醇、單硬脂酸甘油酯、聚異丁烯酸酯、異丁烯酸甲酯、聚乙二醇、以及親水性膠等。
    此外，上述本發明另提供之一種三重交聯之膠原蛋白組合物，其中，更可包括一抗氧化劑、一增黏劑、一安定劑、一賦形劑、一介面活性劑、或其組合，以形成一種低生物排斥性且可長時間植入之膠原蛋白醫材。其應用之範圍並無限制，可應用於牙科、骨科、皮膚科、神經外科、整形外科、或醫藥之載體上，以成為例如微整形醫學美容植入劑、骨修補材、人造真皮、真皮填補、軟骨組織增大、或藥物控制釋放之醫藥載體等用途。
    以下係藉由具體實施例說明本發明之實施方式，熟習此技藝之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地了解本發明之其他優點與功效。此外，本發明亦可藉由其他不同具體實施例加以施行或應用，在不悖離本發明之精神下進行各種修飾與變更。
    實施例1
    1-1　膠原蛋白纖維重組
    由豬皮萃取出豬源之膠原蛋白溶液，將此膠原蛋白溶液與0.2 M，pH 11.2之磷酸緩衝溶液以體積比9：1之比例混合，並於25℃中，緩慢攪拌6小時，以進行膠原蛋白之膠原蛋白纖維重組。接著，以離心方式收集重組後之膠原蛋白纖維，並將其分散於20 mM，pH 7之磷酸緩衝溶液中，得濃度約為2.7 mg/mL之重組膠原蛋白纖維溶液。
    1-2　第一重交聯反應
    以屬於醛類交聯劑之戊二醛作為本實施例之一重交聯劑。將上述濃度約為2.7 mg/mL之重組膠原蛋白纖維溶液加入戊二醛，戊二醛最終濃度為35 ppm。接著，於30℃，pH 7.2下，緩慢攪拌16小時，以進行膠原蛋白分子間及/或分子內之胺基與胺基共價交聯反應，待交聯反應結束後，以離心收集此第一重交聯反應所形成之一重交聯之膠原蛋白纖維。
    1-3　第二重交聯反應
    以屬於環氧化物交聯劑之1,4-丁二醇二縮水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether,BDDE)作為本實施例之第二交聯劑。將一重交聯之膠原蛋白纖維分散至20 mM，pH 4.5之磷酸緩衝液中，得濃度約為2.7 mg/mL之一重交聯之膠原蛋白纖維溶液。接著，於一重交聯之膠原蛋白纖維溶液中加入第二交聯劑1,4-丁二醇二縮水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether,BDDE)，BDDE最終體積百分濃度為1%，再於40℃，pH 4.5下，緩慢攪拌16小時，待交聯反應結束後，以離心收集此第二重交聯反應所形成之二重交聯之膠原蛋白纖維。
    於本實施例之第二重交聯反應中，其第二交聯劑係於酸性條件下進行交聯反應，因此，本實施例之第二重交聯反應，係於一重交聯之重組膠原蛋白纖維之分子間及/或分子內，進行羧基與羧基間之共價交聯反應。
    1-4　第三重交聯反應
    以屬於亞胺類交聯劑1-乙基-3-3-二甲基胺丙基-碳化二亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride,EDC)作為本實施例之第三交聯劑。此外，本實施例之第三交聯劑更包括N-羥基-丁二酸亞醯胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)。將EDC與NHS以莫耳比5：1進行混合，以形成本實施例之第三交聯劑混合物(EDC/NHS)。
    將二重交聯之膠原蛋白纖維分散於0.1M 2-嗎啉乙磺酸(MES)緩衝溶液中(pH 5.5)，得濃度約為2.7mg/mL之二重交聯膠原蛋白纖維溶液，接著，加入第三交聯劑EDC/NHS(莫耳比(molar ratio)5:1)，EDC最終濃度為1%，並於40℃，pH 5.5下，攪拌反應16小時，以進行膠原蛋白分子間及/或分子內之胺基與羧基共價交聯反應，待反應結束後，以離心收集第三重交聯反應後的膠原蛋白纖維產物(即三重交聯之膠原蛋白纖維)。接著，加入第三次交聯膠原蛋白纖維10倍體積之0.1M甘胺酸(glycine)溶液攪拌6小時後，再以離心收集三重交聯之膠原蛋白纖維。
    再以10mM磷酸緩衝溶液(pH 7.0)以10倍體積比例，清洗3次，再離心收集三重交聯之膠原蛋白纖維。 實驗例1
    1-1　交聯度測試
    本實驗例係以三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulphonate,TNBS)試劑進行三重交聯之膠原蛋白纖維之交聯度分析。
    <實驗組1>
    將4mg經凍結乾燥後之三重交聯之膠原蛋白纖維加入1 ml，0.1 M，pH 8.5之碳酸氫鈉溶液(sodium bicarbonate solution)，再加入1 ml，體積百分濃度為0.5%之TNBS溶液，於40℃下，反應2小時。於反應結束後，再加入3 ml，6 N之鹽酸(HCl)，並於60℃下，反應1.5小時。反應結束待反應溶液冷卻至室溫後，再加入去離子水5 ml，均勻混合。取出5 ml之該混合液於螺旋試管中，並加入10 ml之乙醚，均勻震盪後靜置，待液體分層，再將上層乙醚取出。接著，再加入10 ml之乙醚，重複三次上述之步驟。待反應溶液中的乙醚完全揮發後，取400 μl之反應溶液，並加入800μl之去離子水(即反應溶液體積比：去離子水體積比=1：2)均勻混合。最後於波長345 nm下，偵測其吸光值，並套用下式計算交聯度。
    <實驗組2>
    實驗組2之步驟與上述實驗組1之步驟相同，差別僅在於實驗組2所使用之樣品係為無進行交聯反應之凍結乾燥膠原蛋白纖維。
    <對照組>
    對照組之步驟與上述之實驗組1之步驟相同，差別僅在於不加入任何試樣。
    交聯度計算式：
    其中，A為實驗組2之吸光值扣除對照組之吸光值。而B為實驗組1之吸光值扣除對照組之吸光值。
    1-2　酵素降解度測試
    將1g經凍結乾燥之三重交聯之膠原蛋白纖維置於0.1 ml之膠原蛋白酶溶液中(0.5單位/ml，50 mM TES+0.36mM CaCl2.2H2O，pH 7.4)，並於37℃下反應24小時。待反應結束後，以10000 rpm離心10分鐘，取上清液0.2 ml，加入茚三酮(Ninhydrin)1ml，於100℃反應20分鐘後，將反應液冷卻至室溫，於光波長570 nm下，偵測其吸光值。
    最後，本實施例1之結果如表1及圖3本發明三重交聯蛋白之結構示意圖所示。由實施例1所製得之三重交聯之膠原蛋白纖維，其產率係為83%，交聯度係為75.62%，熔點係為82.18℃，酵素降解率係為9.17%。
    實施例2
    2-1　膠原蛋白纖維重組
    與實施例1之膠原蛋白纖維重組步驟相同。
    2-2　第一重交聯反應
    與實施例1之第一重交聯反應步驟相同。
    2-3　第二重交聯反應
    本實施例之第二重交聯反應係以屬於亞胺類交聯劑1-乙基-3-3-二甲基胺丙基-碳化二亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride,EDC)作為本實施例之第二交聯劑，且亦以莫耳比5：1之比例，將EDC與N-羥基-丁二酸亞醯胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)混合，以形成本實施例之第二交聯劑混合物(EDC/NHS)。將離心收集的第一重交聯膠原蛋白分散於0.1M 2-嗎啉乙磺酸(MES)緩衝溶液中(pH 5.5)，得濃度約為2.7mg/mL之一重交聯膠原蛋白纖維溶液，接著加入第二交聯劑EDC/NHS，EDC最終濃度為1%，接著於40℃，pH 5.5下，攪拌反應16小時，以進行膠原蛋白分子間及/或分子內之胺基與羧基共價交聯反應，待反應結束後，以離心收集第二重交聯反應後的膠原蛋白纖維產物，以形成本實施例之二重交聯之膠原蛋白纖維。
    2-4　第三重交聯反應
    本實施例之第三交聯劑係以屬於環氧化物交聯劑之1,4-丁二醇二縮水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether,BDDE)。將上述離心收集之二重交聯膠原蛋白纖維分散至20 mM，pH 4.5之磷酸緩衝液中，得濃度約為2.7 mg/mL之二重交聯之膠原蛋白纖維溶液，接著加入第三交聯劑BDDE BDDE最終體積百分濃度為1%，再於40℃，pH 4.5中，緩慢攪拌16小時，以進行膠原蛋白分子間及/或分子內之羧基與羧基共價交聯反應，反應結束後，再以離心收集三重交聯之膠原蛋白纖維，以形成本實施例之三重交聯之膠原蛋白纖維。接著，加入離心後之交聯膠原蛋白纖維10倍體積之0.1M甘胺酸(glycine)溶液攪拌6小時後，再以離心收集三重交聯之膠原蛋白纖維。
    再以10mM磷酸緩衝溶液(pH 7.0)以10倍體積比例，清洗3次，再離心收集三重交聯之膠原蛋白纖維。
    最後，本實施例之結果同樣如表1所示。由本實施例方法所製得之三重交聯膠原蛋白，其產率係為77%，交聯度係為76.61%，熔點係為84.53℃，酵素降解率係為8.34%。
    實施例3
    3-1　膠原蛋白纖維重組
    由豬皮萃取出豬源之膠原蛋白溶液，將此膠原蛋白溶液與0.2 M，pH 11.2之磷酸緩衝溶液以體積比9：1之比例混合，並於25℃中，緩慢攪拌6小時，以進行膠原蛋白之膠原蛋白纖維重組。接著，以離心方式收集重組後之膠原蛋白纖維，再將離心收集之膠原蛋白纖維分散於0.1M 2-嗎啉乙磺酸(MES)緩衝溶液中(pH 5.5)，得濃度約為2.7mg/mL之重組膠原蛋白纖維溶液。
    3-2　第一重交聯反應
    以屬於亞胺類交聯劑1-乙基-3-3-二甲基胺丙基-碳化二亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride,EDC)作為本實施例之第一交聯劑。此外，本實施例之第一交聯劑更包括N-羥基-丁二酸亞醯胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)。將EDC與NHS以莫耳比5：1進行混合，以形成本實施例之第一交聯劑混合物(EDC/NHS)。
    將第一交聯劑EDC/NHS(莫耳比(molar ratio)5:1)加入已分散於0.1M MES緩衝液(pH 5.5)之重組膠原蛋白纖維溶液中，EDC最終濃度為1%，並於40℃，pH 5.5下，攪拌反應16小時，以進行膠原蛋白分子間及/或分子內之胺基與羧基共價交聯反應，待反應結束後，以離心收集第一重交聯反應後的膠原蛋白纖維產物。
    接著將離心收集第一重交聯反應後的膠原蛋白纖維產物分散於20 mM，pH 7之磷酸緩衝溶液中，得濃度約為2.7 mg/mL之一重交聯膠原蛋白纖維溶液。
    3-3　第二重交聯反應
    以屬於醛類交聯劑之戊二醛作為本實施例之第二交聯劑。將上述濃度約為2.7 mg/mL之一重交聯膠原蛋白纖維溶液加入戊二醛，戊二醛最終濃度為35 ppm。接著，於30℃，pH 7.2下，緩慢攪拌16小時，以進行膠原蛋白分子間及/或分子內之胺基與胺基共價交聯反應，待交聯反應結束後，以離心收集此第二重交聯反應所形成之二重交聯之膠原蛋白纖維。
    3-4　第三重交聯反應
    以屬於環氧化物交聯劑之1,4-丁二醇二縮水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether,BDDE)作為本實施例之第三交聯劑。將二重交聯之膠原蛋白纖維分散至20 mM，pH 4.5之磷酸緩衝液中，得濃度約為2.7 mg/mL之二重交聯之膠原蛋白纖維溶液。接著，將此二重交聯之膠原蛋白纖維溶液加入1,4-丁二醇二縮水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether,BDDE)之第三交聯劑，BDDE最終體積百分濃度為1%，再於40℃，pH 4.5下，緩慢攪拌16小時，以進行膠原蛋白分子間及/或分子內之羧基與羧基共價交聯反應，待交聯反應結束後，以離心收集此第三重交聯反應所形成之三重交聯之膠原蛋白纖維。
    接著，加入第三次交聯膠原蛋白纖維10倍體積之0.1M甘胺酸(glycine)溶液攪拌6小時後，再以離心收集三重交聯之膠原蛋白纖維。
    再以10mM磷酸緩衝溶液(pH 7.0)以10倍體積比例，清洗3次，再離心收集三重交聯之膠原蛋白纖維。
    最後，本實施例之結果同樣如表1所示。由本實施例方法所製得之三重交聯膠原蛋白，其產率係為73.8%，交聯度係為76.43%，熔點係為81.75℃，酵素降解率係為8.11%。
    比較例1
    1-1　膠原蛋白纖維重組
    由豬皮萃取出豬源之膠原蛋白溶液，將此膠原蛋白溶液與0.2 M，pH 11.2之磷酸緩衝溶液以體積比9：1之比例混合，並於25℃中，緩慢攪拌6小時，以進行膠原蛋白纖維重組。接著，以離心方式收集重組之膠原蛋白纖維，並將其分散於20 mM，pH 7之磷酸緩衝溶液中，得濃度約為2.7 mg/mL之重組膠原蛋白纖維溶液。
    1-2　一重交聯反應
    以屬於醛類交聯劑之戊二醛作為本比較例之一重交聯劑。將上述濃度約為2.7 mg/mL之重組膠原蛋白纖維溶液加入戊二醛，戊二醛最終濃度為35ppm。接著，於30℃，pH 7.2下，緩慢攪拌16小時，以進行膠原蛋白分子間及/或分子內之胺基與胺基共價交聯反應，待交聯反應結束後，即離心收集本比較例之一重交聯之膠原蛋白纖維。
    接著，加入一次交聯膠原蛋白纖維10倍體積之0.1M甘胺酸(glycine)溶液攪拌6小時後，再以離心收集一重交聯之膠原蛋白纖維。
    再以10mM磷酸緩衝溶液(pH 7.0)以10倍體積比例，清洗3次，再離心收集本比較例之一重交聯膠原蛋白纖維。
    將本比較例凍結乾燥後之一重交聯之膠原蛋白纖維進行如實驗例1之交聯度及酵素降解率測試，其結果如表1及圖1比較例1之一重交聯之膠原蛋白結構示意圖所示。本比較例之產率雖為91.2%，然而，交聯度卻僅為32.88%，熔點僅為68.33℃，而酵素降解率為100%。由此顯示，以本比較例之方法所製得之一重交聯之膠原蛋白纖維，其交聯度低且酵素降解率高。
    比較例2
    2-1　膠原蛋白纖維重組
    由豬皮萃取出豬源之膠原蛋白溶液，將此膠原蛋白溶液與0.2 M，pH 11.2之磷酸緩衝溶液以體積比9：1之比例混合，並於25℃中，緩慢攪拌6小時，以進行膠原蛋白纖維重組。接著，以離心方式收集重組之膠原蛋白纖維，並將其分散於20 mM，pH 4.5之磷酸緩衝溶液中，得濃度約為2.7 mg/mL之重組膠原蛋白纖維溶液。
    2-2　一重交聯反應
    以屬於環氧化物交聯劑之1,4-丁二醇二縮水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether,BDDE)作為本比較例之一重交聯劑。將上述之2.7 mg/mL之重組膠原蛋白纖維溶液加入BDDE，BDDE最終體積百分濃度為1%，接著於40℃，pH 4.5下，緩慢攪拌16小時，以進行膠原蛋白分子間及/或分子內之羧基與羧基共價交聯反應，待交聯反應結束後，即離心收集本比較例之一重交聯之膠原蛋白纖維。
    接著，加入交聯膠原蛋白纖維10倍體積之0.1M甘胺酸(glycine)溶液攪拌6小時後，再以離心收集交聯之膠原蛋白纖維。
    再以10mM磷酸緩衝溶液(pH 7.0)以10倍體積比例，清洗3次，再離心收集本比較例之一重交聯膠原蛋白纖維。
    將本比較例凍結乾燥之一重交聯之膠原蛋白纖維進行如實驗例1之交聯度及酵素降解度測試，其結果如表1所示。本比較例之產率為38.5%，交聯度為8.5%，熔點為50.33℃，而酵素降解率為34%。由此顯示，以本比較例之方法所製得之一重交聯之膠原蛋白纖維，無論其產率、交聯度、熔點、及酵素降解率皆較實施例1至3不佳。
    比較例3
    3-1　膠原蛋白纖維重組
    由豬皮萃取出豬源之膠原蛋白溶液，將此膠原蛋白溶液與0.2 M，pH 11.2之磷酸緩衝溶液以體積比9：1之比例混合，並於25℃中，緩慢攪拌6小時，以進行膠原蛋白纖維重組。接著，以離心方式收集重組之膠原蛋白纖維，並將其分散於20 mM，pH 9.5之磷酸緩衝溶液中，得濃度約為2.7 mg/mL之重組膠原蛋白纖維溶液。
    3-2　一重交聯反應
    以屬於環氧化物交聯劑之1,4-丁二醇二縮水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether,BDDE)作為本比較例之一重交聯劑。於上述濃度為2.7 mg/mL之重組膠原蛋白纖維溶液中加入BDDE，BDDE最終體積百分濃度為1%，再於40℃，pH 9.5下，緩慢攪拌16小時，以進行膠原蛋白分子間及/或分子內之胺基與胺基共價交聯反應，待交聯反應結束後，即離心收集本比較例之一重交聯之膠原蛋白纖維。
    接著，加入一重交聯膠原蛋白纖維10倍體積之0.1M甘胺酸(glycine)溶液攪拌6小時後，再以離心收集一重交聯之膠原蛋白纖維。
    再以10mM磷酸緩衝溶液(pH 7.0)以10倍體積比例，清洗3次，再離心收集本比較例之一重交聯之膠原蛋白纖維。
    將本比較例凍結乾燥之一重交聯之膠原蛋白纖維進行如實驗例1之交聯度及酵素降解度測試，其結果如表1所示。本比較例之產率為30%，交聯度為50%，熔點為62℃，而酵素降解率為20%。由此顯示，以本比較例之方法所製得之一重交聯之膠原蛋白纖維，同樣無論其產率、交聯度、熔點、及酵素降解率皆明顯較實施例1至3不佳。
    比較例4
    4-1　膠原蛋白纖維重組
    由豬皮萃取出豬源之膠原蛋白溶液，將此膠原蛋白溶液與0.2 M，pH 11.2之磷酸緩衝溶液以體積比9：1之比例混合，並於25℃中，緩慢攪拌6小時，以進行膠原蛋白纖維重組。接著，以離心方式收集重組之膠原蛋白纖維，再分散於0.1M 2-嗎啉乙磺酸(MES)緩衝溶液中(pH 5.5)，得濃度約為2.7 mg/mL之重組膠原蛋白纖維溶液。
    4-2　一重交聯反應
    以屬於亞胺類交聯劑1-乙基-3-3-二甲基胺丙基-碳化二亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride,EDC)作為本比較例之一重交聯劑。此外，本比較例之一重交聯劑更包括N-羥基-丁二酸亞醯胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)。將EDC與NHS以莫耳比5：1進行混合，以形成本比較例之一重交聯劑混合物(EDC/NHS)。
    於上述濃度為2.7 mg/mL之重組膠原蛋白纖維溶液中加入EDC/NHS，EDC最終體積百分濃度為1%，於40℃且pH 5.5之條件下，緩慢攪拌反應16小時，以進行膠原蛋白分子間及/或分子內之胺基與羧基共價交聯反應，待交聯反應結束後，即離心收集本比較例之一重交聯之膠原蛋白纖維。
    接著，加入交聯膠原蛋白纖維10倍體積之0.1M甘胺酸(glycine)溶液攪拌6小時後，再以離心收集一重交聯之膠原蛋白纖維。
    再以10mM磷酸緩衝溶液(pH 7.0)以10倍體積比例，清洗3次，再離心收集本比較例之一重交聯之膠原蛋白纖維。
    將本比較例凍結乾燥之一重交聯之膠原蛋白纖維進行如實驗例1之交聯度及酵素降解度測試，其結果如表1所示。本比較例之產率為72.1%，交聯度為74.44%，熔點為78℃，而酵素降解率為32%。由此顯示，以本比較例之方法所製得之一重交聯之膠原蛋白纖維，同樣無論其產率、交聯度、熔點、及酵素降解率皆較實施例1至3不佳。
    比較例5
    5-1　膠原蛋白纖維重組
    與比較例1之膠原蛋白纖維重組步驟相同。
    5-2　第一重交聯反應
    與比較例1之第一重交聯反應步驟相同。
    5-3　第二重交聯反應
    以屬於環氧化物交聯劑之1,4-丁二醇二縮水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether,BDDE)作為本比較例之第二交聯劑。將本比較例之一重交聯之膠原蛋白纖維，分散至20 mM，pH 4.5之酸性磷酸緩衝液中，得濃度約為2.7 mg/mL之一重交聯之膠原蛋白纖維。接著，加入第二交聯劑1,4-丁二醇二縮水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether,BDDE)，BDDE最終體積百分濃度為1%，再於40℃且pH 4.5下，緩慢攪拌16小時，以進行膠原蛋白分子間及/或分子內之羧基與羧基共價交聯反應，待交聯反應結束後，即離心收集本比較例之二重交聯之膠原蛋白纖維。
    接著，加入二重交聯膠原蛋白纖維10倍體積之0.1M甘胺酸(glycine)溶液攪拌6小時後，再以離心收集二重交聯之膠原蛋白纖維。
    再以10mM磷酸緩衝溶液(pH 7.0)以10倍體積比例，清洗3次，再離心收集本比較例之二重交聯之膠原蛋白纖維。
    將本比較例凍結乾燥之二重交聯之膠原蛋白纖維進行如實驗例1之交聯度及酵素降解度測試，其結果如表1所示。本比較例之產率雖為90%，然而，交聯度為36.94%，熔點為68.33℃，而酵素降解率為17.4%。由此顯示，本比較例雖酵素降解率有部份改善，然而，交聯度、及熔點卻仍較本實施例1至3不佳。
    比較例6
    6-1　膠原蛋白纖維重組
    與比較例1之膠原蛋白纖維重組步驟相同。
    6-2　第一重交聯反應
    與比較例1之第一重交聯反應步驟相同。最後將一重交聯之膠原蛋白纖維分散於0.1M 2-嗎啉乙磺酸(MES)緩衝溶液中(pH 5.5)，得濃度約為2.7 mg/mL之一重交聯之膠原蛋白纖維溶液。
    6-3　第二重交聯反應
    以屬於亞胺類交聯劑1-乙基-3-3-二甲基胺丙基-碳化二亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride,EDC)作為本比較例之第二交聯劑。此外，本比較例之第二交聯劑更包括N-羥基-丁二酸亞醯胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)。將EDC與NHS以莫耳比5：1進行混合，以形成本比較例之第二交聯劑混合物(EDC/NHS)。
    於上述濃度為2.7 mg/mL之一重交聯之膠原蛋白纖維溶液中加入EDC/NHS，EDC最終體積百分濃度為1%，再於40℃且pH 5.5下，緩慢攪拌反應16小時，以進行膠原蛋白分子間及/或分子內之胺基與羧基共價交聯反應，待交聯反應結束後，即離心收集本比較例之二重交聯之膠原蛋白纖維。
    接著，加入二重交聯膠原蛋白纖維10倍體積之0.1M甘胺酸(glycine)溶液攪拌6小時後，以離心收集二重交聯之膠原蛋白纖維。
    再以10mM磷酸緩衝溶液(pH 7.0)以10倍體積比例，清洗3次，再離心收集本比較例之二重交聯之膠原蛋白纖維。
    將本比較例凍結乾燥之二重交聯之膠原蛋白纖維進行如實驗例1之交聯度及酵素降解度測試，其結果如表1所示。本比較例之產率雖為78.7%，交聯度為76.74%，熔點為82.57℃，而酵素降解率為22%。由此顯示，雖然本比較例之熔點及交聯度有部份改善，然而，產率及酵素降解率卻較本實施例1至3不佳。
    比較例7
    7-1　膠原蛋白纖維重組
    與比較例1之膠原蛋白纖維重組步驟相同。
    7-2　第一重交聯反應
    與比較例1之第一重交聯反應步驟相同。最後將一重交聯之膠原蛋白纖維分散於20 mM，pH 9.5之磷酸緩衝溶液中，得濃度約為2.7 mg/mL之一重交聯之膠原蛋白纖維溶液。
    7-3　第二重交聯反應
    以屬於環氧化物交聯劑之1,4-丁二醇二縮水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether,BDDE)作為本比較例之第二交聯劑。於上述濃度為2.7 mg/mL一重交聯之膠原蛋白纖維溶液中加入第二交聯劑BDDE，BDDE最終體積百分濃度為1%，再於40℃且pH 9.5下，緩慢攪拌16小時，以進行膠原蛋白分子間及/或分子內之胺基與胺基共價交聯反應，待交聯反應結束後，即離心收集本比較例之二重交聯之膠原蛋白纖維。
    接著，加入二重交聯膠原蛋白纖維10倍體積之0.1M甘胺酸(glycine)溶液攪拌6小時後，再以離心收集二重交聯之膠原蛋白纖維。
    再以10mM磷酸緩衝溶液(pH 7.0)以10倍體積比例，清洗3次，再離心收集本比較例之二重交聯之膠原蛋白纖維。
    將本比較例凍結乾燥之二重交聯之膠原蛋白纖維進行如實驗例1之交聯度及酵素降解度測試，其結果如表1及圖2比較例7之二重交聯之膠原蛋白結構示意圖所示。本比較例之產率雖為80%，交聯度為71%，熔點為73℃，而酵素降解率為15.3%。由此顯示，雖然本比較例之產率有部份改善，然而，交聯度、熔點及酵素降解率卻仍較本實施例1至3不佳。

    綜合上述，由表1結果配合圖1比較例1之一重交聯之膠原蛋白結構示意圖、圖2比較例7之二重交聯之膠原蛋白結構示意圖、以及圖3本發明三重交聯之膠原蛋白結構示意圖所示。經由本發明三重交聯方法所製得之三重交聯之膠原蛋白，其產率不但保持一定水準，且其高交聯度之結果亦顯示了本發明之三重交聯方法係可使膠原蛋白分子間及/或分子內之胺基與胺基、胺基與羧基及羧基與羧基等官能基進行充分之共價交聯。再則，比較實施例與比較例，由本發明三重交聯方法所製得之三重交聯之膠原蛋白，其交聯度大幅提昇，且熔點亦明顯上升，更甚者，其酵素降解率明顯降低。由此可見，以本發明三重交聯方法所製得之三重交聯之膠原蛋白，其穩定性相較於比較例中之一重交聯及二重交聯之膠原蛋白明顯提昇，故相較於習知以一重交聯方法及二重交聯方法所製得之交聯性膠原蛋白，以本發明三重交聯方法所製得之三重交聯之膠原蛋白，其更適合應用於牙科、骨科、神經外科、整型外科、或醫藥載體之醫療材料。
    上述實驗例僅係為了方便說明而舉例而已，本發明所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於上述實施例。
    圖1係比較例1之一重交聯之膠原蛋白結構示意圖。
    圖2係比較例7之二重交聯之膠原蛋白結構示意圖。
    圖3係本發明三重交聯之膠原蛋白結構示意圖。
    权利要求:
    Claims (24)
    [1] 一種三重交聯之膠原蛋白之製造方法，包括：提供一可溶性之膠原蛋白樣品；混合該膠原蛋白樣品與一第一交聯劑，以形成一重交聯之膠原蛋白，其中，該第一交聯劑係為一選自由：醛類交聯劑、亞胺類交聯劑、及環氧化物交聯劑所組成之群組；混合該一重交聯之膠原蛋白與一第二交聯劑，以形成二重交聯之膠原蛋白，其中，該第二交聯劑係為一選自由：醛類交聯劑、亞胺類交聯劑、及環氧化物交聯劑所組成之群組，且該第二交聯劑係異於該第一交聯劑；以及混合該二重交聯之膠原蛋白與一第三交聯劑，以形成三重交聯之膠原蛋白，其中，該第三交聯劑係為一選自由：醛類交聯劑、亞胺類交聯劑、及環氧化物交聯劑所組成之群組，且該第三交聯劑係異於該第一交聯劑以及該第二交聯劑。
    [2] 如申請專利範圍第1項所述之三重交聯之膠原蛋白之製造方法，其中，於形成該三重交聯之膠原蛋白後，包括有一步驟：混合該三重交聯之膠原蛋白於過量之甘胺酸(glycine)溶液中，另以磷酸緩衝溶液清洗並中和該三重交聯之膠原蛋白。
    [3] 如申請專利範圍第1項所述之三重交聯之膠原蛋白之製造方法，其中，該膠原蛋白樣品係包含一膠原蛋白纖維，且該膠原蛋白樣品係至少一選自由：牛源膠原蛋白、豬源膠原蛋白、羊源膠原蛋白、馬源膠原蛋白、魚源膠原蛋白、及人類膠原蛋白所組成之群組。
    [4] 如申請專利範圍第3項所述之三重交聯之膠原蛋白之製造方法，其中，該膠原蛋白樣品係為至少一選自由：第一型膠原蛋白、第二型膠原蛋白、第三型膠原蛋白、第四型膠原蛋白、及第五型膠原蛋白所組成之群組。
    [5] 如申請專利範圍第3項所述之三重交聯之膠原蛋白之製造方法，其中，該膠原蛋白樣品係為第一型膠原蛋白。
    [6] 如申請專利範圍第1項所述之三重交聯之膠原蛋白之製造方法，其中，該膠原蛋白樣品係包含一重組之膠原蛋白纖維。
    [7] 如申請專利範圍第1項所述之三重交聯之膠原蛋白之製造方法，其中，該醛類交聯劑係至少一選自由：甲醛、乙二醛、及戊二醛所組成之群組。
    [8] 如申請專利範圍第1項所述之三重交聯之膠原蛋白之製造方法，其中，該醛類交聯劑係戊二醛。
    [9] 如申請專利範圍第7項所述之三重交聯之膠原蛋白之製造方法，其中，該醛類交聯劑係於pH 6至pH 9，且反應溫度為20℃至50℃之反應條件中進行交聯反應。
    [10] 如申請專利範圍第7項所述之三重交聯之膠原蛋白之製造方法，其中，該醛類交聯劑之反應濃度係為15 ppm至70 ppm。
    [11] 如申請專利範圍第1項所述之三重交聯之膠原蛋白之製造方法，其中，該亞胺類交聯劑係至少一選自由：1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺(1-ethyl-3-(3dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride(EDC))、1-環己基-3-(2-碼咻代乙基)碳化二亞胺(1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimide(CMC))、二環己基碳化二亞胺(dicyclohexyl carbodiimide(DCC))及二異丙基碳化二亞胺(diisopropyl carbodiimide(DIC))所組成之群組。
    [12] 如申請專利範圍第1項所述之三重交聯之膠原蛋白之製造方法，其中，該亞胺類交聯劑係1-乙基-3-3-二甲基胺丙基-碳化二亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride,EDC)。
    [13] 如申請專利範圍第1項所述之三重交聯之膠原蛋白之製造方法，其中，該亞胺類交聯劑更包括N-羥基-丁二酸亞醯胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)，以形成亞胺類交聯劑混合物。
    [14] 如申請專利爛為第11項所述之三重交聯之膠原蛋白之製造方法，其中，該亞胺類交聯劑係於pH 4至pH 6，且反應溫度為30℃至50℃之反應條件中進行交聯反應。
    [15] 如申請專利爛為第11項所述之三重交聯之膠原蛋白之製造方法，其中，該亞胺類交聯劑之體積百分濃度係為1%至4%。
    [16] 如申請專利範圍第1項所述之三重交聯之膠原蛋白之製造方法，其中，該環氧化物交聯劑係至少一選自由：1,4-丁二醇二縮水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether,BDDE)、乙二醇二縮水甘油醚(ethylene glycol diglycidyl ether,EGDGE)、縮水甘油醚(glycerol polyglycidyl ether)、及二縮水甘油醚(diglycerol polyglycidyl ether)所組成之群組。
    [17] 如申請專利範圍第1項所述之三重交聯之膠原蛋白之製造方法，其中，該環氧化物交聯劑係1,4-丁二醇二縮水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether,BDDE)。
    [18] 如申請專利爛為第16項所述之三重交聯之膠原蛋白之製造方法，其中，該環氧化物交聯劑係於pH 3至pH 5，且反應溫度為30℃至50℃之反應條件中進行交聯反應。
    [19] 如申請專利範圍第16項所述之三重交聯之膠原蛋白之製造方法，其中，該環氧化物交聯劑之體積百分濃度係為0.5%至4%。
    [20] 如申請專利範圍第1項所述之三重交聯之膠原蛋白之製造方法，其中，該第一交聯劑係為醛類交聯劑。
    [21] 如申請專利範圍第1項所述之三重交聯之膠原蛋白之製造方法，其中，該第一交聯劑之作用係為胺基與胺基間之共價交聯反應。
    [22] 一種三重交聯之膠原蛋白組合物，包括：如申請專利範圍第1至21項中任一項所述之三重交聯之膠原蛋白之製造方法所製得之該三重交聯之膠原蛋白；以及一載劑，其中，該三重交聯之膠原蛋白之交聯度係為70-90%，熔點係為80-95%，且酵素降解率係小於10%。
    [23] 如申請專利範圍第22項所述之三重交聯之膠原蛋白組合物，其中更包括：一抗氧化劑、一增黏劑、一安定劑、一賦形劑、一介面活性劑、或其組合。
    [24] 如申請專利範圍第22項所述之三重交聯之膠原蛋白組合物，其係使用於牙科、骨科、神經外科、整形外科、或醫藥之載體。
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